KLT, Bukan Sekedar Analisis Kualitatif (bag.2)

Sebagaimana pembahasan sebelumnya, disebutkan bahwa KLT dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Tapi dengan apa kuantisasi dapat dilakukan? Secara visual dengan mata? Tentu ini sangat subjektif dan sifatnya terkaan saja. Lalu dengan apa?

Ada sebuah alat yang dinamakan densitometer. Sepintas dari namanya, mungkin ada yang mengira bahwa alat ini berfungsi untuk mengukur densitas. Tapi ternyata bukan. Alat ini berfungsi untuk mengukur tingkat kepekatan/kekelaman atau intensitas warna yang terdapat pada suatu permukaan (bidang datar). Atau anda pernah mendengar instrumen yang namanya TLC scanner, alat pindai (scanning) plat KLT. Nah, itulah alat yang dimanfaatkan agar KLT dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Sepertinya di Kampus IPB Taman Kencana (Pusat Studi Biofarmaka) punya tuh. Untuk lebih jelasnya, silahkan konfirmasi ke Pak Agung Zaim.

Lalu bagaimana aplikasinya? Perlu dicatat bahwa spot harus tampak, entah memang senyawanya berwarna, atau penggunakan reagen penampak, atau disinari lampu UV (yang terintegrasi dalam TLC Scanner). Dan pada umumnya, standard dan sampel ditotolkan pada satu plat yang sama, karena lebih menjamin perlakuan yang homogen. Simak ilustrasi berikut sebagai kelanjutan dari tulisan bagian 1.

Pertama, perlu dibuat kurva standard terlebih dahulu menggunakan software KLT (misalnya TLsee). Gambar hasil scanning terhadap plat KLT, dimasukkan ke dalam software. Ketika masuk ke tahap kalibrasi atau pembuatan kurva standard, kita juga diminta untuk mengisi informasi, misalnya judul kalibrasi, nama sampel, dan juga eluen yang digunakan.

Selanjutnya, ketika muncul tampilan plat, silahkan anda blok masing-masing jalur (band) elusi dari setiap standard yang kelihatan spotnya. Anggaplah contoh berikut ini adalah analisis klorofil A. Perhatikan bahwa pada plat ada 3 spot standard klorofil A yaitu 10, 20, dan 40 ppm. Spot yang paling kanan adalah spot sampel daun, yang mengandung klorofil A dan B.

 Setelah kita blog jalur masing-masing standard, kita dapat tampilkan profil kromatogram dari ketiga standard tersebut. Jadi tidak hanya GC dan HPLC aja yang punya kromatogram, tapi KLT juga bisa dibuat kromatogramnya. Kira-kira standard mana ya, yang punya peak area (luas puncak) paling besar? Tentu saja standard ke-3. Mengapa demikian?

Telah kita singgung di bagian 1 bahwa standard yang pekat akan memiliki intensitas warna yang lebih besar. Dan prinsip pengukuran dengan TLC Scanner adalah berdasarkan intensitas warnanya. Selanjutnya jangan lupa untuk melengkapi data kromatogram tersebut dengan memasukkan informasi tentang konsentrasi standard yang dipakai.

Lalu tampilkan kurva standardnya. Maka akan muncul tampilan seperti berikut. Kurva standard akan muncul dan dilengkapi informasi persamaan garisnya menurut regresi linier. Setelah itu dapat anda lanjutkan dengan analisis terhadap spot sampel pada plat yang sama. Caranya sama saja, tinggal blok saja jalur/band dari elusi sampel. Berhubung sampel punya 2 spot, maka akan muncul juga 2 kromatogram.

Tapi manakah yang kita analisis? Tentu saja spot yang Rf-nya sama dengan Rf standard. Langkah selanjutnya, tinggal integrasikan saja luas puncak kromatogram tersebut. Maka akan muncul nilai luas puncak beserta konsentrasinya. Mudah kan? Jadi KLT memang bukan sekedar analisis kualitatif, tapi juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.

Untuk mendownload software TLsee, silahkan klik di sini.
Selamat Belajar